Laboratoř optofyziologie neuronálních okruhů

Všeobecný cíl skupiny je pomoci alespoň několika pacientům, typicky dětem, s farmakorezistentní epilepsíí na podkladě korové malformace. Z tímto účelem: To onemocnění chceme poznat a pochopit

• Přejali jsme a dále upravili metodiku myšího modelu fokální kortikální dysplázie typu II (Natálie Procházková, Monika Řehořová a další).
• V modelu FCDII jsme ve spolupráci s dalšími laboratořemi na ústavu charakterizovali vysokofrekvenční aktivitu nervové tkáně v lézi a jejím okolí (Natálie Procházková, Jan Chvojka z Kudláček Lab; DOI: 10.1016/j.nbd.2023.106383).
• Na úrovni jednotlivých excitačních neuronů, dysmorfních neuronů a inhibičních neuronů jsme studovali morfologické a funkční změny v FCD v průběhu epileptogeneze (Monika Řehořová; publikace v přípravě)
• Ukázali jsme, že dysmorfní neurony v FCDII mají jiný profil aktivity oproti pyramidovým buňkám v myši bez FCD – více burstují, dosahují vyšší maximální frekvence akčních potenciálů, mají nižší průměrnou spontánní aktivitu (Minh-Thao Nguyenová; publikace v přípravě)
• Ukázali jsme, že v části spontánních epileptických záchvatů se dysmorfní neurony v FCDII aktivují a synchronizují dříve, než zbytek neuronů. Zda jde o kauzální roli či korelaci nyní studujeme. Toto by jednoznačně ukazovalo na dysmorfní neurony v FCD jako hlavní terapeutický cíl. V současnosti je rozšiřováno množství dat kvůli velké variabilitě záchvatů (Monika Řehořová, Pavlína Čabounová).
• Zjistili jsme, že u korových záchvatů a v procesu šířící se depolarizace patrně hrají specifickou roli různé podtypy inhibičních interneuronů. Například parvalbumin-pozitivní interneurony, neurony vysílající inhibiční synapse na tělo okolních neuronů, mají oproti jiným buňkám stále vysokou intracelulární koncentraci vápníku mnoho sekund po ukončení záchvatu. Toto by mohlo ukázat na jejich specifickou roli v ukončnování záchvatu, což je stále neobjasněný mechanismus. Nyní jsou nabírána data v akutním experimentu, kdy je sledována dynamika vápníku v těchto inhibičních buňkách na konci záchvatu a v komplementárních experimentech pak jejich napěťová aktivita. Znalost specifického typu neuronů nám umožní lépe cílit (Jana Populová, začátek projektu).

Jedním z nových cílů je také vytvoření alternativního a rychlejšího modelu „FCD“. V tomto případě kůry vystavené působení dysmorfních neuronů indukovaném v dospělém věku. FCDII je obecně způsobena somatickou mutací v PI3K/Akt/mTOR signalizační dráze. Jedna z publikovaných aktivizačních mutací je v malém regulátorové GTPáze zvané RHEB. Její genetickou informaci je možné zabalit do adenoasociovaného viru a dopravit ji do korových neuronů dospělé myši bez epilepsie. Dříve bylo ukázáno, že v myším modelu, kde použili in utero elektroporaci, ale mutovaný gen aktivovali v dospělosti, došlo k rozvoji záchvatů. Záchvaty tedy nebyly závislé na neuspořádané kůře, ale spíše na přítomnosti neuronů nesoucí mutaci. Tuto situaci chceme docílit vnesením mutace do neuronů dospělé myši, kde předpokládáme, že i v takové myši se rozvine epilepsie. Tento model má teoreticky velkou výhodu v až 5x větším výtěžku oproti elektroporaci, možnosti cílit lézi do specifických částí kůry myši a možnosti nastavit frakci mutovaných neuronů. Takový model nejen může být použit k objasnění pozice léze a její hustoty na míru epileptogenicity, ale také může být použit jako jednodušší model pro screening léčiv farmaceutickými firmami. (Carl VL Olson, vývoj a testování modelu, počáteční fáze)

Na základě literatury a mnoha našich předběžných dat jsme ukázali, že dysmorfní mutované buňky FCDII vykazují znak senescentních buněk. To jsou buňky, kde došlo k neopravitelnému poškození DNA, akumulaci zlomů DNA, aktivaci prozánětlivého sekretomu. Tyto buňky mají aktivované počáteční kroky apoptotické dráhy, ale tu mají zablokovanou vlastní zvýšenou expresí blokátorů apoptózy (BCL2 rodina proteinů). Našim cílem je použít látky (tzv. senolytika), které jsou schopné blokovat ony blokátory apoptózy a tím dysmorfní neurony v tkáni selektivně eradikovat. Za tímto účelem používáme pokročilou preparaci myši s FCDII, operaci s kraniálním oknem, videoEEG konektorem a chronickou kanulou jdoucí přímo do mozkového parenchymu v místě FCD. Senolytika budou do okolí dysmorfních neuronů pouštěna chronickou subkutánní osmotickou pumpou připojenou ke kanule. Prostřednictvím kraniálního okna a intravitální dvoufotonové mikroskopie můžeme sledovat, zda a jak jdou jednotlivé dysmorfní neurony do apoptózy. Na videoEEG jednotce pak budeme pozorovat, zda vymizí epileptické záchvaty. (Ondřej Novák, začátek projektu podpořeného grantem AZV).

Jsme součástí spolupráce s laboratoří dr. Kudové na ÚOCHB AVČR, kde testujeme vliv nově syntetizovaných neuroaktivních steroidů excitabilitu mozku a jeho přechod do záchvatu v akutním a chronickém epileptickém modelu. Specificky pak pomocí dvoufotonové mikroskopie studujeme, které neurony a mechanismy jsou neurosteroidy nejvíce ovlivněny. (Jan Daněk, 2024 počátek projektu)

Občas si některý z přístrojů místo nákupu vyrobíme, nebo popřípadě oproti komerčně dostupným alternativám zdokonalíme pro používané účely. Vyvinuli jsme vlastní elektroporátor, kde jsme zabudovali analogovou proudovou limitaci pro ochranu embryí a prevenci kompletního potratu. Přístroj jsme navrhli tak, aby mohl být zkonstruován během několika dnů jen se základní znalostí pájení a 3D tiskárnou. Design, komplexní ověření účinnosti v experimentu a návody na sestavení jsme publikovali. (MinhThao Nguyenová, Natálie Procházková, Ondřej Novák; DOI: 10.1016/j.jneumeth.2024.110126)